農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) 2009,28(3):597-601 Journal of Agro-Environment Science

聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦不同生長(zhǎng)階段及 餌料藻類的安全性研究

王 群，劉 淇，李 峰，李 健

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

摘 要：采用藥浴方式，研究了一種新型消毒劑—聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦受精卵、無(wú)節(jié)幼體、幼蝦、成蝦的毒性及餌料藻類的影響。結(jié)果表明，聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦 24、48 h 的LC50  為 64.1 mg·L-1  和 31.13 mg·L-1，安全濃度 Sc 為 2.20 mg·L-1；聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦成蝦 24、48 h 的LC50  為 66.17 mg·L-1  和 32.16 mg·L-1，安全濃度 Sc 為 2.28 mg·L-1，為了保證凡納濱對(duì)蝦的安全性，聚六亞甲基雙胍的用量應(yīng)控制在 0.5 mg·L-1  之內(nèi)；聚六亞甲基雙胍在 125 mg·L-1  濃度內(nèi)對(duì)受精卵的孵化率無(wú)明顯影響，0.5 mg·L-1  濃度以內(nèi)對(duì)無(wú)節(jié)幼體的變態(tài)率無(wú)明顯影響。聚六亞甲基雙胍對(duì)球等鞭金藻和亞心形扁藻表現(xiàn)出了明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其對(duì)球等鞭金藻和亞心形扁藻的生長(zhǎng)不產(chǎn)生抑制的最高濃度為 5 mg·L-1；聚六亞甲基雙胍對(duì)球等鞭金藻 48、96、144 h 的 EC50  為 27.01、34.95 mg·L-1  和 33.14 mg·L-1；亞心形扁藻為 34.65、28.73 mg·L-1  和 20.57 mg·L-1，聚六亞甲基雙胍對(duì)兩種藻類的安全濃度分別 3.5 mg·L-1  和 2.9 mg·L-1，表明聚六亞甲基雙胍對(duì)亞心形扁藻的影響更明顯。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦；聚六亞甲基雙胍；餌料藻類；安全性

中圖分類號(hào)：X592 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672- 2043(2009)03- 0597- 05

Security on Different Growth Stages of Litopenaeus vannamei and Feeding Algae of Polyhexamethylene Biguanide（PHMB）

WANG Qun, LIU Qi, LI Feng, LI Jian

（Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China） Abstract：The security of polyhexamethylene biguanide（PHMB）on different growth stages of Litopenaeus vannamei and feeding algae were in－ vestigated. The results showed：cumulative mortality of juvenile and adult Litopenaeus vannamei increased with increasing concentration of PHMB. 24 h and 48 h median lethal concentrations（LC50）of PHMB on juvenile shrimp of  Litopenaeus vannamei were 64.1  mg·L-1  and

31.13 mg·L-1, and security concentration（Sc）was 2.20 mg·L-1. 24 h and 48 h median lethal concentrations（LC50）of PHMB on adult shrimp of Litopenaeus vannamei were 66.17 mg·L-1  and 32.16 mg·L-1, and security concentration（Sc）was 2.28 mg·L-1. In order to guarantee security on culturing Litopenaeus vannamei, the using amount of PHMB should below 0.5 mg·L-1. Hatching and metamorphosis test showed：hatching rate of control group was 87%, and hatching rate of test group was the range of 79%~92%. There was no significant influence on hatching rate of zygote when the concentration of PHMB below 125 mg·L-1, and there was no significant influence on metamorphosis rate of nauplius when the concentration of PHMB below 0.5 mg·L-1. With the increase of PHMB concentration, the growth inhibition rate of Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis was increasingly apparent. There was an excellent relationship between dose and effect of PHMB on Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis, and the sensitivity of Platymonas subcordiformis to PHMB is higher than Isochrysis galbana. The highest concentration of no significant influence of PHMB on Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis was 5 mg·L-1. 48 h, 96 h and 144 h EC50  of PHMB on Isochrysis galbana were 27.01, 34.95 mg·L-1  and 33.14 mg·L-1, and the corresponding concentrations of Platymonas

subcordiformis were 34.65，28.73 mg·L-1  and 20.57 mg·L-1. According to the classification of aquatic organisms toxicity, the toxicity of PHMB to Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis belonged to moderate toxicity.

Keywords：Litopenaeus vannamei; polyhexamethylene biguanide（PHMB）; feeding algae; security

收稿日期：2008-05-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃“工程化養(yǎng)殖高效生產(chǎn)體系構(gòu)建技術(shù)研究與開發(fā)”（2006BAD09A03）；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“對(duì)蝦養(yǎng)殖管理信息系統(tǒng)研究與建立”（nyhyzx07-042）

作者簡(jiǎn)介：王  群（1973—），女，山東蓬萊人，博士，副研究員，從事水產(chǎn)藥理學(xué)研究。E-mail：[email protected]

通訊作者：李  健  E-mail：[email protected]

598

王 群等：聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦不同生長(zhǎng)階段及餌料藻類的安全性研究

2009 年 3 月

近年來(lái)，含氯消毒劑在防治對(duì)蝦細(xì)菌性疾病方面發(fā)揮了巨大的作用[1-3]。但這些含氯消毒劑存在溶解性差、刺激性強(qiáng)和安全性不好等副作用，使用時(shí)其使用效果往往受水體中酸堿度和有機(jī)物的影響，聚六亞甲基雙胍（polyhexamethylene biguanide，PHMB）屬于陽(yáng)離子表面活性劑，無(wú)色無(wú)味、易溶于水、性質(zhì)穩(wěn)定，殺菌過程中不發(fā)生強(qiáng)氧化反應(yīng)，通過細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生沉淀作用及細(xì)胞內(nèi)磷的數(shù)量上升，阻礙細(xì)胞壁與核酸的合成[4-5]，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能，在食品行業(yè)、環(huán)境消毒等方面得到了應(yīng)用[6-7]；近年來(lái)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)也得到一定程度的應(yīng)用[8-9]。

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又名南美白對(duì)蝦，具有生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，1988   年從美國(guó)夏威夷引進(jìn)我國(guó)，1992   年人工繁殖獲得成功，目前占我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的 70%左右。本文采用藥浴方式研究聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦受精卵、無(wú)節(jié)幼體、幼蝦、成蝦的安全性及餌料藻類的影響，評(píng)價(jià)聚六亞甲基雙胍對(duì)對(duì)蝦的毒性效應(yīng)及生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，為藥物合理安全使用提供必要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

聚六亞甲基雙胍（含量 20%），試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)已換算為純的聚六 亞甲基雙胍表示。

球等鞭金藻、亞心形扁藻由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供。

凡納濱對(duì)蝦及其受精卵、無(wú)節(jié)幼體由青島卓越水產(chǎn)養(yǎng)殖股份公司提供。

凡納濱對(duì)蝦幼蝦和成蝦購(gòu)自青島南山市場(chǎng)。

1.2 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦和成蝦的急性毒性試驗(yàn)

采用半靜水法藥浴方式，24 h 更換 100％試液，試

1.3 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦受精卵和無(wú)節(jié)幼體毒性試驗(yàn)

1.3.1 凡納濱對(duì)蝦受精卵孵化率的影響試驗(yàn)

將受精卵放入配制好的不同濃度聚六亞甲基雙胍溶液中浸泡一定時(shí)間后，用 100 目篩絹濾掉消毒劑溶液，然后用干凈的海水充分沖洗去除殘留在受精卵表面的消毒劑；再放入盛有 300 mL 孵化水的燒杯中孵化，每個(gè)燒杯放入 30 粒受精卵，每組 90 粒。試驗(yàn)水溫 27~28 ℃，pH 8.0，鹽度 31。試驗(yàn)過程中不充氣，不換水，24 h 后對(duì)孵化出的無(wú)節(jié)幼體進(jìn)行計(jì)數(shù)。采用 χ2檢驗(yàn)比較試驗(yàn)組和對(duì)照組受精卵孵化率的顯著性差異。

1.3.2 凡納濱對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率的影響試驗(yàn)

試驗(yàn)在 500 mL 玻璃燒杯中進(jìn)行，將凡納濱對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體分別放入盛有已配制好的 400 mL 不同濃度聚六亞甲基雙胍溶液的燒杯中，觀察記錄 40 h 各組無(wú)節(jié)幼體變?yōu)樵闋钣左w的情況。每個(gè)燒杯中放入 50 尾無(wú)節(jié)幼體，每組 150 尾。試驗(yàn)水溫 28~30 ℃，pH8.0，鹽度 31。試驗(yàn)過程中不充氣，不換水。

1.4 聚六亞甲基雙胍對(duì)餌料藻類的影響試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)中聚六亞甲基雙胍的濃度，試驗(yàn)濃度梯度按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置；試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè) 3 個(gè)平行重復(fù)。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻種用藻類培養(yǎng)液調(diào)整為適宜濃度，分裝在 250 mL 經(jīng)干熱滅菌的錐形瓶中（200 mL·瓶-1），初始濃度為（3.08±0.14）×104  個(gè)·mL-1；然后加入聚六亞甲基雙胍系列標(biāo)準(zhǔn)液，使藻液中的聚六亞甲基雙胍的濃度為0、5、10、20、40、80、160 mg·L-1，每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)平行重復(fù)，混勻后自然光 24 h 恒溫（20±1）℃培養(yǎng)，每日振蕩 3~4 次。每間隔 48 h 用顯微鏡觀察藻細(xì)胞狀態(tài)，并按帕森斯等[10]的方法采集樣本，在血球計(jì)數(shù)板上計(jì) 數(shù)，取算數(shù)平均值。

用生長(zhǎng)面積法[11]計(jì)算 96 h EC50：

驗(yàn)均設(shè)平行重復(fù)。凡納濱對(duì)蝦幼蝦體長(zhǎng) 4.6~5.5 cm，

IA=（AC-A）t

/AC×100%

成蝦體長(zhǎng) 11.3 ~12.7 cm，海水 pH8.0，鹽度 31，水溫

25.1~26.2 ℃，動(dòng)物數(shù)量 30 尾·組-1，設(shè)平行重復(fù)；試驗(yàn)過程中不充氣。

試驗(yàn)中觀察記錄 24、48 h 死亡數(shù)。毒性試驗(yàn)結(jié)果用半數(shù)致死濃度（LC50）和安全濃度（Sc）表示；半數(shù)致死濃度（LC50）采用移動(dòng)平均角法計(jì)算；安全濃度（Sc）采用下式計(jì)算：

A=（N1-N0）/2×t1+（N1  +N2-2N0）2×（t2-t1）+…+（Nn-1

+N -2N）/2×（t -t  ）

式中：IA  為生長(zhǎng)抑制百分率；AC  為空白組生長(zhǎng)曲線以下面積；At  為受試濃度生長(zhǎng)曲線以下面積：A 為生長(zhǎng)曲線下面積；Nn  為 tn  時(shí)刻細(xì)胞密度；tn  為試驗(yàn)開始后第 n 次計(jì)數(shù)時(shí)間。

以 IA  為縱坐標(biāo)和濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，IA =

Sc=（24

48 hLC50×0.3

50/48 hLC50）2

50%所對(duì)應(yīng)的濃度即為 EC50。

安全濃度（CS）：CS  = 96 h EC

50×0.1

第 28 卷第 3 期 農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 科 學(xué) 學(xué) 報(bào)

599

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性

聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦和成蝦 24、48 h 的死亡率見表 1~表 2。凡納濱對(duì)蝦幼蝦和成蝦的死亡率隨聚六亞甲基雙胍暴露濃度的增加而增加，隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

2.2 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦受精卵和無(wú)節(jié)幼體毒性

聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦受精卵孵化率和無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率的影響如表 3 和表 4。對(duì)照組的孵化率為 87%，試驗(yàn)組的孵化率為 79%~92%，與對(duì)照組對(duì)蝦受精卵孵化率差異不顯著（P>0.05），表明聚六亞甲基雙胍 125 mg·L-1  濃度以內(nèi)處理凡納濱對(duì)蝦受精卵 10~30 min 對(duì)其孵化率無(wú)明顯影響。當(dāng)聚六亞甲基雙胍的濃度為 1.0 mg·L-1，凡納濱對(duì)蝦幼體的變態(tài)率為 81%，與對(duì)照組之間差異顯著（P<0.05）；當(dāng)聚六亞甲

基雙胍的濃度為 0.5 mg L-1

不同濃度聚六亞甲基雙胍對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果見表 5。隨著聚六亞甲基雙胍質(zhì)量濃度的升高，球等鞭金藻的生長(zhǎng)受抑制愈加明顯，當(dāng)聚六亞甲基雙胍的質(zhì)量濃度為 80 mg·L-1  時(shí)，球等鞭金藻的生長(zhǎng)完全受到抑制并最終導(dǎo)致其死亡，抑制率為100%。低質(zhì)量濃度組（5 mg·L-1）的細(xì)胞生長(zhǎng)不受抑制，48 h 的高質(zhì)量濃度組（40 mg·L-1）的抑制率比低質(zhì)量濃度組（10 mg·L-1）抑制率增加了 2 倍左右，96 h 和 144 h 的高質(zhì)量濃度組（40 mg·L-1）的抑制率比低質(zhì)量濃度組（10 mg·L-1）增加了 3 倍左右。低質(zhì)量濃度組

（5、10、20 mg·L-1）隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制不明顯；高質(zhì)量濃度組（40 mg·L-1）隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制越明顯，其 48、96、144 h 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為 57.0%、81.8%、94.4%。聚六亞

表 4 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率的影響

Table 4 Effect of PHMB on metamorphosis rate of nauplius

藥物濃度/mg·L-1

concentration 0 0.125  0.25    0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

態(tài)率為 95%，與對(duì)照組之間差異不顯著（P>0.05）。

變 態(tài) 率 /% metamorphosis rate

100    100    100 95 81** 0** 0** 0**

2.3 聚六亞甲基雙胍對(duì)餌料藻類影響試驗(yàn)

2.3.1 聚六亞甲基雙胍對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

注：每個(gè)試驗(yàn)組與空白對(duì)照組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，表中變態(tài)率右上角的“**”表示 χ2 檢驗(yàn)差異極顯著（P<0.01）。

表 1 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Toxicity of PHMB on juvenile shrimp of Penaeus vannamei

注：24 h LC50：64.1 mg·L-1，95%置信范圍為 48.09~83.02 mg·L-1；48 h LC50：31.13 mg·L-1，95%置信范圍為 25.12~38.37 mg·L-1；Sc（安全濃度）：2.20 mg·L-1。

表 2 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦成蝦的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Toxicity of PHMB on adult shrimp of Penaeus vannamei

注：24 h LC50：66.17 mg·L-1，95%置信范圍為 48.99~86.69 mg·L-1；48 h LC50：32.16 mg·L-1，95%置信范圍為 26.13~39.43 mg·L-1；Sc （安全濃度）：

2.28 mg·L-1。

表 3 聚六亞甲基雙胍對(duì)凡納濱對(duì)蝦受精卵孵化率的影響

Table 3 Effect of PHMB on hatching rate of zygote